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本试剂盒是针对Illumina或者MGI测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容cfDNA样本的建库。该试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接时的片段自连现象，同时替换了新型高保真酶，进一步提升了扩增的均一性和保真性。

• 适用500pg～1μg的基因组DNA、全长cDNA(衔接Hiper NGS ds-cDNA Synthesis Kit全长cDNA合成试剂盒，货号：SY0834)等样本；
  
• 高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性；
  
• 片段化、末端修复/加A一步完成；
  
• 强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量；
  
• 适用于cfDNA样本；
  
• 严格的批次性能与稳定性质控。

• 关于操作
  
  • 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
    
  • 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
    
  • 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
    
  • 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
    
  • 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
    
  • PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
    
  • 本制品仅作科研用途！
• 关于接头连接（Adapter Ligation）
  Illumina接头：
  
  • 本公司可提供短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。
    目前有双端384种Index Primers:Hiper NGS 384 CDI Primer for Illumina(货号：SY0836)。
    
  • 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
    
  • 使用接头时，请提前将接头取出放在4℃或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25℃，防止接头解链。
    
  • 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5μL，请根据初始的DNA或者RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4℃保存48小时。
    表1．Input Total RNA/DNA量与接头使用浓度推荐表
    

    Input Total RNA （参照SY0834 RNA投入量）	Adapter stock concentration	Input Total DNA	Adapter stock concentration
    ≥10ng	15μM	1μg～200ng	15μM
    ＜10ng	3μM	100ng	10μM
    		50ng	5μM
    		10ng	3μM
    		5ng	1μM
    		≤1ng	0.5μM

• 关于文库扩增
  文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1mg文库的推荐循环数。
  表2．Input Total RNA或者DNA量与扩增循环数推荐表*
  

  Input Total RNA	Number of cycles	Input Total DNA	Number of cycles
  ＜1ng	10~12	＜1ng	14~16
  1ng	9~10	1ng	13~14
  10ng	6~7	5ng	10~11
  50ng	4~5	10ng	9~10
  100～1000ng	4	50ng	7~8
  		100ng	6~7
  		200ng	5~6

  
  注：由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
  
• DNA磁珠纯化与分选
  
  • 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hiper NGS DNA Selection Beads或AMPure XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
    
  • 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
    
  • 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
    
  • 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
    
  • 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
    
  • 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3～5min足以让磁珠充分干燥。
    
  • DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4℃可保存2天，-20℃可保存1个月。
• 关于文库质检
  
  • 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
    
  • 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit、PicoGreen等；基于qPCR绝对定量的方法。
    
  • 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
    
  • 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop等。
    
  • 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
• 自备材料
  
  • DNA纯化磁珠：Hiper NGS DNA Selection Beads或AMPure XP Beads（A63880）或其他等效产品。
    
  • Adapters：含Index的长接头（SY0845/SY0846/SY0847/SY0848）或者无Index的短接头试剂盒（SY0851/SY0852）。
    
  • 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
    
  • 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。